南湖新聞網訊（通訊員 劉越）近日，農(nong) 業(ye) 微生物資源發掘與(yu) 利用全國重點實驗室、湖北洪山實驗室、我院動物育種與(yu) 健康養(yang) 殖前沿科學中心晏向華教授團隊研究成果以“Precise digital bacteria enumeration and antibiotic susceptibility testing via a portable vibrating capillary-based droplet platform”為(wei) 題在Sensors and Actuators B: Chemical發表，研究開發了一種基於(yu) 微流控液滴技術的數字化活細菌計數與(yu) 抗生素敏感性測試新方法。
抗生素耐藥性是人類健康的重大威脅，傳(chuan) 統的抗生素敏感性測試方法如肉湯稀釋法、紙片擴散法等存在檢測時間長、樣品消耗量大等不足，無法有效滿足快速診斷的需求。研發快速、準確、便攜的細菌抗生素敏感性測試方法與(yu) 平台，對於(yu) 生豬健康養(yang) 殖過程中規定的“飼料端無抗、養(yang) 殖端減抗、產(chan) 品端無抗”的抗生素含量和耐藥性細菌產(chan) 生的即時檢測具有重要意義(yi) 。
液滴數字化計數分析（droplet digital counting）是將原始樣本分散至大量等體(ti) 積的納升級微液滴中，每個(ge) 液滴作為(wei) 一個(ge) 獨立的生物反應器，通過對包含待測目標的液滴（陽性液滴）進行識別和計數，根據泊鬆分布可實現待測目標的絕對定量。由於(yu) 細菌被限製在納升級空間中生長，有利於(yu) 自身及代謝產(chan) 物的富集，數字化細菌分析與(yu) 抗生素敏感性測試可以大大縮短信號檢測所需的孵育時間。微流控芯片是目前最常用的數字化離散平台，然而現有芯片的製作與(yu) 操作對專(zhuan) 業(ye) 設備、技能及成本的要求較高，且微液滴的體(ti) 積和數量難以靈活調節，限製了數字化分析的動態範圍和精確度。
研究人員研發了一種聲波驅動的可控微液滴生成技術與(yu) 平台，該平台僅(jin) 由一根由壓電膜片控製的玻璃毛細管、一個(ge) 便攜式信號發生器和一個(ge) 液滴收集池組成，裝置簡單、操作簡便，且成本低廉。該液滴技術可高通量生成單分散微液滴，通過改變聲波信號參數，液滴體(ti) 積從(cong) 0.016 nL至26.4 nL連續、實時、靈活可調，可滿足多體(ti) 積數字化細菌計數的需求。利用該技術，研究人員將活性指示劑刃天青與(yu) 細菌共同包裹於(yu) 兩(liang) 種不同體(ti) 積的微液滴中。細菌在液滴中繁殖會(hui) 使指示劑反應並產(chan) 生紅色熒光；當微液滴經過孵育後，內(nei) 含活細菌的液滴可顯示熒光信號，而未包裹細菌或包裹死細菌的液滴則無明顯熒光信號。通過熒光成像，結合自主開發的圖像與(yu) 數據處理程序，可快速實現陽性和陰性液滴的識別與(yu) 統計，並根據泊鬆分布，計算出樣本中的活細菌濃度。該方法可在5×10 2 CFU/mL至1×10 7 CFU/mL的範圍內(nei) 實現活細菌的快速、準確計數；且與(yu) 單體(ti) 積液滴相比，多體(ti) 積液滴分析極大提高了計數的動態範圍和準確性。
研究人員進一步在液滴平台上集成了一個(ge) 3D打印旋轉進樣切換裝置，通過中央切換閥的旋轉，可實現不同樣品的靈活切換與(yu) 液滴生成，滿足不同濃度抗生素處理與(yu) 檢測的需求。將細菌、抗生素和指示劑共同包裹於(yu) 液滴中，通過計算不同濃度抗生素處理下樣品中細菌的存活率，擬合得到抗生素濃度與(yu) 細菌存活率的關(guan) 係曲線，可以準確評估抗生素的最小抑菌濃度。該方法可將抗生素敏感性測試時間由傳(chuan) 統方法的20小時以上縮短至5小時，且通過微液滴體(ti) 積的靈活調節可實現單個(ge) 液滴中細菌濃度的精確設置，準確評估細菌初始接種濃度對抗生素敏感性測試結果的影響。
星空体育网站入口官网理學院丁馳竹副教授、碩士研究生劉越為(wei) 共同第一作者，星空体育网站入口官网動科動醫學院何子怡副研究員、晏向華教授為(wei) 共同通訊作者。該研究受到了國家自然科學基金、星空体育网站入口官网自主科技創新基金和農(nong) 業(ye) 微生物重大基礎設施項目的資助。
審核人：丁馳竹 何子怡 晏向華
【論文英文摘要】Antibiotic resistance can lead to multidrug-resistant superbugs and threaten global health, putting forward a high demand for accurate and fast antibiotic susceptibility testing (AST). Conventional AST methods are labor-intensive and time-consuming, far from meeting the requirement for rapid clinical decision-making. Here, we develop a portable vibrating capillary-based droplet platform for precise digital bacteria enumeration and rapid AST. Multi-volume droplets encapsulating bacteria with or without antibiotics are generated on demand, and the elevated fluorescence from resazurin reduction is measured, which corresponds to the growing bacteria. Automated data analysis is achieved by a self-developed image processing program. Multi-volume droplet digital counting allows precise bacteria enumeration over a wide dynamic range spanning more than 4 orders of magnitude. Droplet digital AST of ampicillin against E. coli demonstrates that it is feasible for accurately assessing the minimum inhibitory concentration and investigating the inoculum effect, with the assay time reduced to 5 hr. In sum, this method is easy to operate, cost-effective, with high accuracy and short time-to-result, which is highly promising for rapid and precise assessment of antimicrobial susceptibility in resource-limited settings.
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